猪弓形虫体内诱导抗原对NF-κB信号通路的影响

【摘要】刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)是由法国学者于1908年发现的能广泛寄生于包括人在内的所有温血动物有核细胞内的一种寄生虫,它能引起严重的人畜共患弓形虫病。人类对弓形虫具有较强的自然免疫能力,免疫功能正常的成年人感染后多呈隐形感染,但是对于一些免疫功能受损、免疫缺陷者或者先天性弓形虫感染者,往往会造成严重的后果,因而弓形虫病的有效防治是极为重要的。弓形虫生活史复杂,包括组织包囊、卵囊、配子体、速殖子和缓殖子等众多发育形式,此外在长期的寄生生活中,弓形虫发展出很多的免疫逃避机制以逃避宿主的免疫攻击。而弓形虫在入侵的过程中,体内诱导抗原会在宿主内大量表达,推测可能是宿主的免疫系统释放了免疫因子刺激其体内诱导抗原的表达。哺乳动物转录因子NF-κB家族是B细胞中κB轻链的调控原件,也是动物主动免疫过程中关键性的调控因子。NF-κB家族的转录调控与炎性反应、细胞凋亡、细胞增殖、分化以及存活都有着一定关联,同时NF-κB信号通路还是宿主免疫系统调控的重要手段。因此体内诱导抗原与NF-κB信号通路极可能有潜在的相互作用。本研究首先将实验室之前的同学已经筛选获得的猪弓形虫体内诱导抗原阳性结果中的部分抗原基因进行体内外表达差异的验证,PCR扩增基因全长的ORF；然后利用双荧光素酶检测方法检测了这些抗原对NF-κB信号通路的激活效应,并在TNF-a刺激下检测了它们对该信号通路的抑制效应。具体工作包括以下几个方面：(1)猪弓形虫体内诱导抗原体内外表达差异的验证及全长ORF的PCR扩增选择本实验室之前的同学筛选得到的14个猪弓形虫体内诱导抗原阳性克隆中的5个功能蛋白,即亮氨酸重复序列(LRL)、钙调蛋白(CaM)、D-3-磷酸甘油酸脱氢酶(D3)、致密颗粒蛋白5(GRA5)、致密颗粒蛋白15(GRA15),同时包括3个未知功能的假定蛋白,TOX.DB上的编号分别为TGGT1-098800(暂称G1)、TGME49-212160(M4)、TGGT1-059670(JK),根据各自的ORF设计引物,real-timePCR检测感染弓形虫速殖子72个小时的BALB/c鼠中的虫子和BHK细胞中培养相同时长的弓形虫速殖子中这8个基因nRNA相对表达水平的差异。结果显示,BALB/c鼠体内速殖子内这8个基因中有6个的表达量都显著高于体外BHK中的表达量,统计学分析差异显著(P<0.05)。另外LRL和M4体内外表达差异并不明显。利用数据库中的基因全长CDS序列设计了真核表达引物,分别克隆这6个基因的ORF片段,连接真核表达载体PCMV-tag2B,构建了带Flag标签的真核表达质粒。(2)猪弓形虫体内外表达差异抗原对NF-κB信号通路激活效应的影响利用双荧光素酶检测方法,验证体内诱导抗原对NF-κB信号通路的影响。利用已经构建好的NF-κB转录的调控元件(启动子或3UTR)克隆在萤火虫荧光素酶基因的上游,构建荧光素酶报告质粒,使之作为受调控的报告基因,再将海肾荧光素酶基因作为内对照,在细胞中同时转染以上两种质粒,检测NF-κB信号通路的激活。以报道过的弓形虫ME49株(typeⅡ型)的GRA15作为阳性对照,结果显示,体内诱导抗原RH株(typeI型)GRA15有显著的激活NF-KκB信号通路的效应。但是随后的NF-κB原件p65的核转移实验未能成功验证这一结果。(3)猪弓形虫体内外表达差异抗原对NF-κB信号通路抑制效应的影响同样利用双荧光素酶检测方法,以NF-κB信号通路的刺激物TNF-a的添加作为激活组,在同样的刺激剂量和时间作用下,观察载体组和体内诱导基因组对NF-κB信号通路抑制效应的影响。通过多次重复实验,相比较载体组均未发现这些基因有抑制NF-κB信号通路的作用。(4)致密颗粒蛋白GRA15(Ⅰ/Ⅱ)免疫原性的研究typeⅠ型和Ⅱ型的GRA15都和免疫相关的NF-κB信号通路有一定关联,我们利用小鼠模型求证了这两个都能激活NF-κB信号通路的基因在BALB/c鼠体内诱导免疫应答的能力。三次免疫后检测了弓形虫全虫裂解抗原刺激抗体产生水平、淋巴细胞增值情况以及IL2、IL4、IL12和IFN-γ的产生情况,虽然结果都呈阴性,但是仍然为探索更为有效的弓形虫疫苗提供一定的理论参考和借鉴。
【作者】李妮智；
【导师】周艳琴；
【作者基本信息】华中农业大学，预防兽医学，2014，硕士
【关键词】刚地弓形虫；体内诱导抗原；NF-κB信号通路；DNA疫苗；GRA15；

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